Порівняльне дослідження нативних і кріоконсервованих мезенхімальних стовбурових клітин щурів: життєздатність клітин, експресія імунологічних генів і продукція цитокінів
DOI:
https://doi.org/10.31210/spi2026.29.02.27Ключові слова:
мезенхімальні стовбурові клітини (МСК), кріоконсервація, життєздатність клітин, експресія імуномодулювальних генів, профіль секреції цитокінів, паракринна трофічна активністьАнотація
Кріоконсервація є фундаментальним біопроцесом для банкінгу мезенхімальних стовбурових клітин (МСК), проте цикл заморожування-розморожування спричиняє субклітинний стрес, що потенційно модифікує посткріогенний геномний та секреторний профіль клітин. Це дослідження мало на меті порівняти біологічну, молекулярну та функціональну стабільність нативних і кріоконсервованих мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку щурів (Rattus norvegicus BM-MSCs) після розморожування. МСК кісткового мозку щурів було розподілено на дві групи: некріоконсервовані контрольні клітини (Fresh-MSCs) та клітини, заморожені протягом 4 тижнів у рідкому азоті з використанням 10 % диметилсульфоксиду (Cryo-MSCs). Виживання клітин визначали за допомогою колориметричного аналізу з використанням 3-(4,5-диметилтіазол-2-іл)-2,5-дифенілтетразоліум броміду. Рівні експресії імунорегуляторних (Il10, Tgfβ1, Ido1) та апоптичних (Bax, Casp3, Bcl2) транскриптів оцінювали методом зворотної транскрипції з наступною кількісною ПЛР у реальному часі (ЗТ-кПЛР). Концентрації секретованих білків IL-10, TGF-β, TNF-α, IL-6, VEGF та HGF у супернатанті кількісно визначали за допомогою імуноферментного аналізу (ELISA). Процес кріоконсервації призвів до статистично значущего зниження виживання клітин після розморожування відносно нативного контролю, хоча життєздатність клітин залишалася на безпечно високому функціональному рівні (87,32±2,91 проти 100,00±3,67 %; P<0,001). На транскрипційному рівні у групі Cryo-MSCs виявлено глибоке пригнічення експресії всіх ключових імуномодулювальних транскриптів (P≤0,05), при цьому рівні Il10, Tgfβ1 та Ido1 знизилися до 0,68±0,07, 0,77±0,06 та 0,61±0,06 відповідно. Це узгоджувалося з падінням концентрацій секретованих протизапальних білків IL-10 та TGF-β на 21,58 та 21,87 % (P≤0,05), що відбувалося паралельно з втратою приблизно від 15 до 20 % паракринної секреції факторів VEGF та HGF (P≤0,01). Навпаки, кріогенний шок активував гостру стресову відповідь, яка суттєво порушила мітохондріальне співвідношення маркерів апоптозу, викликаючи значуще 1,61-кратне зростання проапоптичного транскрипту Bax та 1,49-кратне підвищення рівня ефекторної каспази Casp3 на тлі 30,0 % зниження мРНК антиапоптичного гена Bcl2 (P≤0,05). Виявлені зміни експресії генів призвели до функціонального перепрограмування секретому кріоконсервованих клітин після розморожування у бік запального фенотипу, що характеризувалося різким підвищенням рівнів секретованих білків TNF-α та IL-6 у 2,12 та 1,59 раза відповідно (P≤0,05). Стандартна кріоконсервація ефективно зберігає життєздатність клітин, проте викликає тимчасове погіршення їхнього функціонального стану, що охоплює транскрипційне пригнічення імуномодулювальних мереж, тенденцію до зниження продукції трофічних факторів та активацію проапоптичних сигнальних шляхів. Отримані результати свідчать про зниження функціональної якості МСК безпосередньо після розморожування, що підкреслює клінічну необхідність оптимізації періоду реакліматизації або інкубації клітинного продукту перед його введенням
Посилання
1. Law, S., & Chaudhuri, S. (2013). Mesenchymal stem cell and regenerative medicine: regeneration versus immunomodulatory challenges. American Journal of Stem Cells, 2(1), 22–38.
2. Han, X., Liao, R., Li, X., Zhang, C., Huo, S., Qin, L., Xiong, Y., He, T., Xiao, G., & Zhang, T. (2025). Mesenchymal stem cells in treating human diseases: molecular mechanisms and clinical studies. Signal Transduction and Targeted Therapy, 10(1), 262. https://doi.org/10.1038/s41392-025-02313-9
3. Esmael, G. K., Rebai, T., & Al-Nailey, K. G. C. (2023). Immunomodulatory effects of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on BALB/c mice model with induced systemic lupus erythematosus (SLE): effects of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Cellular and Molecular Biology, 69(1), 19–24. https://doi.org/10.14715/cmb/2022.69.1.4
4. Song, N., Scholtemeijer, M., & Shah, K. (2020). Mesenchymal stem cell immunomodulation: mechanisms and therapeutic potential. Trends in Pharmacological Sciences, 41(9), 653–664. https://doi.org/10.1016/j.tips.2020.06.009
5. Wang, J., & Li, R. (2024). Correction: Effects, methods and limits of the cryopreservation on mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy, 15(1), 372. https://doi.org/10.1186/s13287-024-04001-x
6. Wang, Y., Yang, K., Yuan, S., Huo, F., Yang, C., & Tian, W. (2026). Research advances in cryopreserved preparations of mesenchymal stem cells: technical innovations, application challenges, and quality control. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 14, 1717539. https://doi.org/10.3389/fbioe.2026.1717539
7. Antebi, B., Asher, A. M., Rodriguez, L. A., Moore, R. K., Mohammadipoor, A., & Cancio, L. C. (2019). Cryopreserved mesenchymal stem cells regain functional potency following a 24-h acclimation period. Journal of Translational Medicine, 17(1), 297. https://doi.org/10.1186/s12967-019-2038-5
8. Tan, Y., Salkhordeh, M., Wang, J.-P., McRae, A., Souza-Moreira, L., McIntyre, L., Stewart, D. J., & Mei, S. H. J. (2019). Thawed mesenchymal stem cell product shows comparable immunomodulatory potency to cultured cells in vitro and in polymicrobial septic animals. Scientific Reports, 9(1), 18078. https://doi.org/10.1038/s41598-019-54462-x
9. Clarke, D. M., Yadock, D. J., Nicoud, I. B., Mathew, A. J., & Heimfeld, S. (2009). Improved post-thaw recovery of peripheral blood stem/progenitor cells using a novel intracellular-like cryopreservation solution. Cytotherapy, 11(4), 472–479. https://doi.org/10.1080/14653240902887242
10. Bahsoun, S., Coopman, K., & Akam, E. C. (2020). Quantitative assessment of the impact of cryopreservation on human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: up to 24 h post-thaw and beyond. Stem Cell Research & Therapy, 11(1), 540. https://doi.org/10.1186/s13287-020-02054-2
11. Ray, S. S., Pramanik, K., Sarangi, S. K., & Jain, N. (2016). Serum-free non-toxic freezing solution for cryopreservation of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Biotechnology Letters, 38(8), 1397–1404. https://doi.org/10.1007/s10529-016-2111-6
12. Mamo, T., Cox, C. A., Demorest, C., Fontaine, M. J., Hubel, A., Kelley, L., Khan, A., Marks, D. C., Pati, S., Reems, J.-A., Spohn, G., Schäfer, R., Shi, R., Shao, L., Stroncek, D., & McKenna, D. H. (2024). Cryopreservation of mesenchymal stem/stromal cells using a DMSO-free solution is comparable to DMSO-containing cryoprotectants: results of an international multicenter PACT/BEST collaborative study. Cytotherapy, 26(12), 1522–1531. https://doi.org/10.1016/j.jcyt.2024.07.001
13. Putra, I., Shen, X., Anwar, K. N., Rabiee, B., Samaeekia, R., Almazyad, E., Giri, P., Jabbehdari, S., Hayat, M. R., Elhusseiny, A. M., Ghassemi, M., Mahmud, N., Edward, D. P., Joslin, C. E., Rosenblatt, M. I., Dana, R., Eslani, M., Hematti, P., & Djalilian, A. R. (2021). Preclinical evaluation of the safety and efficacy of cryopreserved bone marrow mesenchymal stromal cells for corneal repair. Translational Vision Science & Technology, 10(10), 3. https://doi.org/10.1167/tvst.10.10.3
14. Shah, F. S., Li, J., Zanata, F., Curley, J. L., Martin, E. C., Wu, X., Dietrich, M., Devireddy, R. V., Wade, J. W., & Gimble, J. M. (2016). The relative functionality of freshly isolated and cryopreserved human adipose-derived stromal/stem cells. Cells Tissues Organs, 201(6), 436–444. https://doi.org/10.1159/000446494
15. Xu, X., Liu, Y., Cui, Z., Wei, Y., & Zhang, L. (2012). Effects of osmotic and cold shock on adherent human mesenchymal stem cells during cryopreservation. Journal of Biotechnology, 162(2-3), 224–231. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2012.09.004
16. Shivakumar, S. B., Bharti, D., Jang, S.-J., Hwang, S.-C., Park, J.-K., Shin, J.-K., Byun, J.-H., Park, B.-W., & Rho, G.-J. (2015). Cryopreservation of human Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells following controlled rate freezing protocol using different cryoprotectants; a comparative study. International Journal of Stem Cells, 8(2), 155–169. https://doi.org/10.15283/ijsc.2015.8.2.155
17. Ryan, J. M., Barry, F., Murphy, J. M., & Mahon, B. P. (2007). Interferon-γ does not break, but promotes the immunosuppressive capacity of adult human mesenchymal stem cells. Clinical and Experimental Immunology, 149(2), 353–363. https://doi.org/10.1111/j.1365-2249.2007.03422.x
18. Holan, V., Hermankova, B., Bohacova, P., Kossl, J., Chudickova, M., Hajkova, M., Krulova, M., Zajicova, A., & Javorkova, E. (2016). Distinct immunoregulatory mechanisms in mesenchymal stem cells: role of the cytokine environment. Stem Cell Reviews and Reports, 12(6), 654–663. https://doi.org/10.1007/s12015-016-9688-y
19. François, M., Copland, I. B., Yuan, S., Romieu-Mourez, R., Waller, E. K., & Galipeau, J. (2012). Cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunosuppressive properties as a result of heat-shock response and impaired interferon-γ licensing. Cytotherapy, 14(2), 147–152. https://doi.org/10.3109/14653249.2011.623691
20. Moll, G., Alm, J. J., Davies, L. C., von Bahr, L., Heldring, N., Stenbeck-Funke, L., Hamad, O. A., Hinsch, R., Ignatowicz, L., Locke, M., Lönnies, H., Lambris, J. D., Teramura, Y., Nilsson-Ekdahl, K., Nilsson, B., & Le Blanc, K. (2014). Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties? Stem Cells, 32(9), 2430–2442. https://doi.org/10.1002/stem.1729
21. Nasef, A., Chapel, A., Mazurier, C., Bouchet, S., Lopez, M., Mathieu, N., Sensebé, L., Zhang, Y., Gorin, N.-C., Thierry, D., & Fouillard, L. (2006). Identification of IL-10 and TGF-β transcripts involved in the inhibition of T-lymphocyte proliferation during cell contact with human mesenchymal stem cells. Gene Expression, 13(4), 217–226. https://doi.org/10.3727/000000006780666957
22. Zhao, Z.-G., Li, W.-M., Chen, Z.-C., You, Y., & Zou, P. (2008). Hematopoiesis capacity, immunomodulatory effect and ex vivo expansion potential of mesenchymal stem cells are not impaired by cryopreservation. Cancer Investigation, 26(4), 391–400. https://doi.org/10.1080/07357900701788049
23. Bissoyi, A., & Pramanik, K. (2014). Role of the apoptosis pathway in cryopreservation-induced cell death in mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood. Biopreservation and Biobanking, 12(4), 246–254. https://doi.org/10.1089/bio.2014.0005
24. Moll, G., Geißler, S., Catar, R., Ignatowicz, L., Hoogduijn, M. J., Strunk, D., Bieback, K., & Ringdén, O. (2016). Cryopreserved or fresh mesenchymal stromal cells: only a matter of taste or key to unleash the full clinical potential of MSC therapy? In K. Bieback, D. Strunk, & G. Geißler (Eds.), Mesenchymal stromal cells: analytical and technical advancements (pp. 77–98). Springer. https://doi.org/10.1007/978-3-319-45457-3_7
25. Aabling, R. R., Alstrup, T., Kjær, E. M., Poulsen, K. J., Pedersen, J. O., Revenfeld, A. L., Møller, B. K., & Eijken, M. (2023). Reconstitution and post-thaw storage of cryopreserved human mesenchymal stromal cells: Pitfalls and optimizations for clinically compatible formulants. Regenerative Therapy, 23, 67–75. https://doi.org/10.1016/j.reth.2023.03.006
26. Linkova, D. D., Rubtsova, Y. P., & Egorikhina, M. N. (2022). Cryostorage of mesenchymal stem cells and biomedical cell-based products. Cells, 11(17), 2691. https://doi.org/10.3390/cells11172691
27. Li, W., Liu, Q., Shi, J., Xu, X., & Xu, J. (2023). The role of TNF-α in the fate regulation and functional reprogramming of mesenchymal stem cells in an inflammatory microenvironment. Frontiers in Immunology, 14, 1074863. https://doi.org/10.3389/fimmu.2023.1074863
28. Majumdar, M. K., Thiede, M. A., Haynesworth, S. E., Bruder, S. P., & Gerson, S. L. (2000). Human marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) express hematopoietic cytokines and support long-term hematopoiesis when differentiated toward stromal and osteogenic lineages. Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research, 9(6), 841–848. https://doi.org/10.1089/152581600750062264
29. Hemeda, H., Jakob, M., Ludwig, A.-K., Giebel, B., Lang, S., & Brandau, S. (2010). Interferon-γ and tumor necrosis factor-α differentially affect cytokine expression and migration properties of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development, 19(5), 693–706. https://doi.org/10.1089/scd.2009.0365
30. González-González, A., García-Sánchez, D., Dotta, M., Rodríguez-Rey, J. C., & Pérez-Campo, F. M. (2020). Mesenchymal stem cells secretome: The cornerstone of cell-free regenerative medicine. World Journal of Stem Cells, 12(12), 1529–1552. https://doi.org/10.4252/wjsc.v12.i12.1529
31. Kehl, D., Generali, M., Mallone, A., Heller, M., Uldry, A.-C., Cheng, P., Gantenbein, B., Hoerstrup, S. P., & Weber, B. (2019). Proteomic analysis of human mesenchymal stromal cell secretomes: a systematic comparison of the angiogenic potential. npj Regenerative Medicine, 4(1), 8. https://doi.org/10.1038/s41536-019-0070-y
32. Hsiao, S. T.-F., Asgari, A., Lokmic, Z., Sinclair, R., Dusting, G. J., Lim, S. Y., & Dilley, R. J. (2012). Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells and Development, 21(12), 2189–2203. https://doi.org/10.1089/scd.2011.0674
Downloads
Опубліковано
Як цитувати
Номер
Розділ
Ліцензія
Ця робота ліцензується відповідно до Creative Commons Attribution 4.0 International License.
